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Th17 检测原理和样品处理方法

作者:联科生物    发布日期:2019-10-13 08:00



1.背 景 介 绍

我们通常所说的Th1、Th2和Th17是指T辅助细胞(严格意义上是Th0细胞)在各种生理与病理条件下分化为Th1、Th2和Th17的能力。静息状态(即未受任何刺激,如人的正常生理状态)下,Th0分化为Th1、Th2和Th17的能力非常弱,所以外周血中仅含有极少量的Th1、Th2和Th17细胞,这时我们所能检测到的IFN-γ、IL-4、IL-17A也微乎其微。而当Th细胞受到外界因素,如刺激素,病原体等刺激,其中Th0即会向Th1、Th2或Th17大量分化,具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时,我们检测到的IFN-γ、IL-4或IL-17A也较多。实验中我们检测的Th1、Th2和Th17实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。
 
我们通常选用的刺激素为 PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。
 
其中PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物,PKC则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化,形成级联反应,导致许多蛋白的表达,进而引起T细胞的活化。在细胞内,PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共同作用而激活,因此在Ionomycin(Ca2+的转运剂,可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内)的参与下,T细胞内PKC可被进一步激活。可见,PMA与Ionomycin协同活化T细胞。
也有人选用其它刺激剂来活化T细胞,如CD3/CD28协同刺激,PHA刺激等。实验表明,PMA为广谱性刺激,即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活,而CD3/CD28协同刺激和PHA刺激,则是通过TCR受体的作用,仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。
 
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外,而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原,所以应阻断细胞因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体(Golgi),因细胞因子(即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工和转运,才能到达细胞膜,然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径,干扰其分泌。通常选用的阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素 A)和/或 Monensin (莫能霉素)。
另外,实验过程中涉及到如何正确的选定Th(即T辅助细胞)的问题。Th细胞的表面标志为CD3+CD4+,而当用PMA刺激4小时时,会发现CD4+的细胞明显减少,甚至消失,这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以通常的做法是用CD3和CD8反设CD4细胞,即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。(注:PMA对小鼠CD4的影响很小,所以检测小鼠Th1/Th2/Th17时可用CD4直接设门)。
 
抗凝剂的选择也非常重要。使用肝素钠和肝素锂作为抗凝剂,不影响Th细胞的活化和细胞因子的分泌,而使用 EDTA 和枸橼酸钠作为抗凝剂则无法检测到细胞因子。此时,应使用 PBMCs而不是抗凝血进行刺激。
 

2.实 验 步 骤

【 样 本 制 备 】

A. 全血标本

用肝素抗凝管采集静脉血(必须用肝素钠抗凝,不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠)1-2ml,血液室温或4℃放置,8小时内必须进行检测,否则需弃用。

B. 外周血单个核细胞(PBMC)标本

1) 对于使用其它抗凝剂(如EDTA或枸橼酸钠)抗凝血,采集静脉血至少1ml,采集后4小时内使用;
2)加入等体积的Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水稀释血液;
3)取1ml淋巴细胞分离液(Cat# LSM01或MLSM1092,联科生物)加入离心管中;
4)将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上,注意保持两者界面清晰;
5)室温下,1500r/min,离心15分钟;
6)用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层,加入含有4-5ml Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水的试管中,充分混匀;
7)1500r/min,离心10分钟,弃上清后,再洗一次;
8)弃上清,用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);
9)调节细胞浓度为1x107细胞/ml。
 

【需要的产品】(以MultiSciences Th17检测试剂盒为例)
Human —— 人Th17染色试剂盒/Human Th17 staining kit
组分 编号 25T 100T
抗人 CD3, FITC (克隆号:OKT3) AH00301 150 μl 600 μl
抗人 CD8α, PerCP-Cy5.5 (克隆号:RPA-T8) AH008A07 150 μl 600 μl
抗人 IL-17A, PE (克隆号:(64DEC17) AH0I1704 150 μl 600 μl
佛波酯/离子霉素混合物 (250×) CS1001 100 μl 200 μl
布雷非德菌素 A/莫能霉素混合物 (250×) CS1002 100 μl 200 μl
固定破膜剂试剂 A GASA 3 ml 11 ml
固定破膜剂试剂 B GASB 3 ml 11 ml
流式染色缓冲液 (10×) S1002 15 ml 60 ml
 
Mouse——小鼠Th17染色试剂盒/ Mouse Th17 staining kit
组分 编号 25T 100T
抗小鼠 CD3ε, FITC (克隆号:145-2C11) AM003E01 150 μl 600 μl
抗小鼠 CD4, PerCP- Cy5.5 (克隆号:GK1.5) AM00407 150 μl 600 μl
抗小鼠 IL-17A, PE (克隆号:17B7) AM0I1704 150 μl 600 μl
佛波酯/离子霉素混合物 (250×) CS1001 100 μl 200 μl
布雷非德菌素 A/莫能霉素混合物 (250×) CS1002 100 μl 200 μl
固定破膜剂试剂 A GASA 3 ml 11 ml
固定破膜剂试剂 B GASB 3 ml 11 ml
流式染色缓冲液 (10×) S1002 15 ml 60 ml
 
【其他可能需要的产品】
产品名称 编号 规格 供应商
人淋巴细胞分离液 LSM01 200ml MultiSciences
小鼠淋巴细胞分离液 MLSM1092 200ml MultiSciences
4% 多聚甲醛 F0001 100ml MultiSciences
补偿调节微球 01-1111-41 25 tests Thermo Fisher
 
【预实验检测刺激效果】
1) 全血标本:取125ul抗凝血至流式管中,加入125μl不含血清的培养基稀释到250ul;PBMC标本:用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);调节细胞浓度为1×107/ml,取250ul;
2) 在标本中加入250× PMA/Ionomycin (Multisciences #CS1001) 1ul,混匀;
3) 37℃,5% CO2 培养箱培养 4~6 小时,期间注意相隔 1~2 小时混匀一次;
4) 取 100ul 样本,加入 Human CD3(或 Mouse CD4)和 CD69 PE(用量详见说明书),室温孵育20分钟(全血样本溶血)后,用流式染色缓冲液(Multisciences #S1001)洗一遍,300g离心5分钟,弃上清,用流式染色缓冲液重悬至500ul,上机检测;
5) CD3+(或CD4+)细胞中,CD69的阳性率应达到90%以上,进行下一步正式实验。
 

【正式实验】
1a. 全血标本:取125μl抗凝血至流式管中,加入125μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture(250×)和1μl BFA/Monensin Mixture(250×)。取125μl抗凝血和125μl不含血清的培养基,作为对照。混匀,37℃孵育4 - 6小时,每隔1 - 2小时取出震荡混匀。
1b. PBMC标本:用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,使细胞浓度为1×107/ml。取250μl PBMCs 至流式管中,加入1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含PBMCs 的样本作为对照。混匀,37℃孵育4 - 6 小时,每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。
注:PMA/Ionomycin Mixture (250×)和 BFA/Monensin Mixture (250×)极易挥发,使用后请及时旋紧管盖。
2. 从样本管和对照管中取 100 μl 细胞悬液至新的流式管中,加入5μl Anti-Human CD3, FITC 和5 μl Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5(或加入5μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5)。震荡混匀,室温避光孵育 15 分钟。
3. 每管加入 100 μl FIX & PERM Medium A,震荡混匀,室温避光孵育 15 分钟。
4. 用蒸馏水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×,每管加入2 ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer,300 ×g离心5分钟,弃上清。
注:液体尽量倒干净,不要有残留。
5. 每管加入 100 μl FIX & PERM Medium B 和 5 μl Anti-Human IL-17A, PE(或5 μl Anti-Mouse IL-17A, PE)。震荡混匀,室温避光孵育 15 分钟。
6. 每管加入2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer,300×g 离心 5 分钟,弃上清。
7. 每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬,上机检测;或者加入500μl 1-4 %多聚甲醛重悬,2- 8℃避光,于24小时内检测。

 

【结果示例】

图1. 使用 Human Th17 Staining Kit 进行流式检测。静息的肝素抗凝血(A0)和 EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (B0)染色 IL-17A。PMA/Ionomycin 刺激的肝素抗凝血(A1)和 EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (B1)染色 IL-17A。对 CD3+/CD8-细胞进行设门分析。实验在 Thermo Fisher 公司的 Attune NxT 流式细胞仪上进行。志愿者的健康状况未详。


图2. 使用 Mouse Th17 Staining Kit 进行流式检测。正常 ICR 小鼠的静息肝素抗凝血(A0)、EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (B0)、脾细胞(C0)和脾单个核细胞(D0)染色 IL-17A。正常 ICR 小鼠的 PMA/Ionomycin刺激的肝素抗凝血(A1)、EDTA 抗凝血来源的 PBMC (B1) 脾细胞(C1)和脾单个核细胞(D1)染色 IL-17A。对 CD3+/CD4+细胞进行设门分析。实验在 Thermo Fisher 公司的 Attune NxT 流式细胞仪上进行。
 

 
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